1. ALA增強蘋果耐鹽性并特異性誘導MdPP2AC表達

鹽脅迫下，ALA預處理可顯著緩解蘋果無根苗葉片褐化，緩解葉綠素含量下降；NaCl可誘導PP2A酶活性上升，ALA進一步強化該效應。在MdPP2AC家族中，只有基因ID為LOC103451899的MdPP2AC受到鹽脅迫和ALA共同上調，啟動子活性也被二者共同激活，提示 MdPP2AC可能是ALA誘導蘋果耐鹽性的重要候選基因。

圖1 ALA增強蘋果耐鹽性及MdPP2AC表達響應

2. MdPP2AC是ALA誘導蘋果耐鹽性的正調控因子

過表達MdPP2AC（OE）可顯著提升蘋果葉片耐鹽性，減少鹽脅迫導致的細胞死亡，維持葉綠素含量，增強SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性，抑制H₂O₂ 、O₂^•¯ 及MDA積累，促進脯氨酸合成；PP2A特異性抑制劑（CT）則加劇鹽損傷，而ALA可緩解CT的抑制效應。這些證據顯示，MdPP2AC是ALA誘導蘋果耐鹽通路的關鍵下游因子。

圖2 MdPP2AC介導 ALA 促進蘋果愈傷組織耐鹽性

3. MdPP2AC介導 ALA 促進蘋果愈傷組織耐鹽性

在正常生長條件下，野\生型（WT）、OE-MdPP2AC及 RNAi-MdPP2AC蘋果愈傷組織生長沒有顯著差異；而在鹽脅迫條件下，OE-MdPP2AC 愈傷組織的鮮重顯著高于 WT 和 RNAi，抗氧化酶活性增強，O₂^•¯和 MDA 積累減少，同時Cl⁻含量顯著升高。進一步添加外源ALA，則OE-MdPP2AC細胞系上述生理響應被進一步增強，但RNAi-MdPP2AC明顯削弱ALA的促進效應。這些結果說明，MdPP2AC促進蘋果細胞內Cl⁻積累與氧化還原穩態，在ALA增強蘋果愈傷組織耐鹽性中發揮關鍵作用。

圖3 MdPP2AC對蘋果愈傷組織耐鹽性的影響

4. MdPP2AC促進根部 Cl⁻截留并減少向地上部運輸

鹽脅迫下，OE-MdPP2AC 生根苗葉片褐化程度更輕，葉綠素含量和相對含水量更高，抗氧化能力更強；OE 株系根部Cl⁻含量顯著升高，葉片Cl⁻含量降低，CT 處理則相反，ALA 可逆轉 CT 的影響。MQAE 熒光探針檢測證實，OE-MdPP2AC促進根系成熟區Cl⁻積累，ALA 進一步增強該效應，表明 ALA誘導的MdPP2AC能夠促進Cl⁻截留于根系成熟區以維持植株氯離子穩態。

圖4 MdPP2AC調控蘋果根部Cl⁻分布及耐鹽性

5. 蘋果全基因組MdCLC成員鑒定及其對NaCl和ALA的響應

Cl⁻跨膜轉運和區室化由氯離子通道蛋白（CLC）介導。在蘋果基因組中，存在著11個MdCLC家族成員，可分為6個亞家族（標記為b-g），其中 MdCLC-b1/c1/c2/d1的表達受 MdPP2AC 和 ALA 上調，提示這些基因可能參與 MdPP2AC 介導的 ALA 誘導蘋果耐鹽通路。

圖5 MdCLC基因家族成員的全基因組鑒定及其對NaCl和ALA處理的響應

6. MdPP2AC 與液泡膜蛋白 MdCLC-c2 互作

酵母雙雜交（Y2H）、雙分子熒光互補（BiFC）和螢火蟲熒光素酶互補（LCI）實驗證實，MdPP2AC 可與 MdCLC-c2 直接互作，與 MdCLC-b1 弱互作，不與 MdCLC-c1 互作。亞細胞定位顯示，MdCLC-c2 與液泡膜標記蛋白 RFP-VAC 共定位，確認為液泡膜蛋白。

圖6 MdPP2AC 與 MdCLC-c2 互作驗證及定位

7. MdCLC-c2 的 C 端 Glu⁶⁸⁴殘基是互作關鍵位點

AlphaFold 預測顯示 MdPP2AC 與 MdCLC-c2 的 C 端 CBS 結構域互作；截短實驗表明，MdCLC-c2 的 aa^488-539和 aa^540-758區域是互作必需的。點突變實驗證實，Glu⁶⁸⁴→Ala可完全阻斷二者互作，表明 Glu⁶⁸⁴是 MdPP2AC 與 MdCLC-c2 互作的核心殘基。

圖7 MdPP2AC 與 MdCLC-c2 互作關鍵位點鑒定

8. MdPP2AC 與 MdCLC-c2 協同 ALA 增強酵母耐鹽性

酵母Δgef1突變體對鹽敏感，異源表達MdCLC-c2可部分恢復耐鹽性，共表達MdPP2AC則顯著增強該效應，ALA處理進一步提升耐鹽性。胞內Cl⁻含量檢測顯示，MdCLC-c2 可促進 Cl⁻積累，MdPP2AC和ALA協同強化該過程。以上實驗證實，二者通過調控Cl⁻轉運增強細胞耐鹽性。