近日，Horticultural Plant Journal正式刊發南京農業大學園藝學院汪良駒教授團隊題為“MdWRKY71 as a positive regulator involved in 5-aminolevulinic acid-induced salt tolerance in apple（MdWRKY71 作為一個正向調節因子參與5-氨基乙酰丙酸誘導的蘋果耐鹽性）”的研究論文。

1. 研究背景：

蘋果屬于中度鹽敏感型果樹，土壤鹽漬化時常困擾著蘋果生長與生存。尤其是，近年來由于肥水管理不當引起的土壤次生鹽漬化，嚴重影響蘋果生長發育、產量和品質，因此有效提高蘋果耐鹽性具有社會和經濟重大意義。

5-氨基乙酸丙酸（5-Aminolevulinic acid, ALA）是一種新型植物生長調節物質。在草莓受到鹽脅迫時，ALA能夠提高植株葉片與根系的抗氧化酶活性，并且誘導Na⁺和Cl⁻截留于根中，從而減少其吸收運輸以及在葉片中積累，進而達到增強植物耐鹽性的目的。在蘋果上，ALA可以促進花青苷合成，進而促進蘋果著色，而且這一過程經由轉錄因子MdWRKY71介導。然而，MdWRKY71能否介導ALA提高蘋果耐鹽性，迄今未見到報道。

2. 研究問題：

探究ALA和MdWRKY71緩解蘋果鹽脅迫傷害效應，分析MdWRKY71調控的下游基因及其在蘋果耐鹽中的作用機理。

3. 研究結果：

(1) 將嘎啦蘋果葉片置于在鹽溶液中，24 h時出現葉片鹽傷害癥狀(Fig. 1)。這種傷害程度隨著鹽處理時間延長而加重，葉片失綠，細胞死亡。若添加外源ALA，則顯著減輕葉片褐化，減少細胞傷害，緩解鹽脅迫引起的葉綠素含量下降。qRT-PCR檢測顯示，NaCl顯著上調MdWRKY71表達，而ALA能進一步促進MdWRKY71表達。亞細胞定位結果顯示，MdWRKY71蛋白位于細胞核內；GUS染色顯示，MdWRKY71啟動子活性受到NaCl和ALA的顯著誘導，證明這是一個響應NaCl和ALA處理的轉錄因子。

Fig. 1 ALA promotes salt tolerance of apple leaves and MdWRKY71 is an ALA-responsive transcription factor under salt stress

(2) qRT-PCR檢測顯示(Fig. 2)，蘋果葉片蛋白激酶基因MdSOS2、Na⁺轉運蛋白基因MdSOS1、MdSOS3和MdNHX1，Cl⁻轉運蛋白基因MdCLC-a/b、MdCLC-c1和MdCLC-g以及抗氧化酶基因MdSOD1、MdPOD1、MdCAT1、MdAPX1和MdGR1的表達均響應鹽脅迫刺激，而ALA可以進一步促進這些基因表達，暗示ALA提高蘋果耐鹽性可能與其調控離子平衡和活性氧平衡有關。

Fig. 2 ALA promotes gene expressions associated with salt tolerance in apple leaves under NaCl stress

(3) 過表達（OE）-MdWRKY71能顯著減輕鹽脅迫對嘎啦蘋果葉片傷害以及愈傷細胞生長的抑制，緩解葉綠素含量下降，同時促進抗氧化酶（SOD，CAT，APX）活性提高，抑制H₂O₂、O₂^•¯積累和MDA上升；而干擾（RNAi）-MdWRKY71表達則呈現相反趨勢。ALA顯著增強三種基因型蘋果離體葉片和愈傷細胞耐鹽性(Fig. 3)，證明ALA可能通過MdWRKY71來增強蘋果抗氧化酶活性，進而提高葉片和愈傷細胞耐鹽性。

Fig. 3 MdWRKY71 is involved in ALA-enhanced salt tolerance of apple

(4) 將OE-MdWRKY71轉入煙草，則轉基因植株耐鹽性顯著提高。ALA處理可以提高野升型煙草植株耐鹽性，還能進一步提高轉基因植株耐鹽性(Fig. 4)。在這過程中，MdWRKY71和ALA緩解鹽脅迫誘導的葉片葉綠素下降，提高葉片相對含水量，抑制Na⁺和Cl⁻含量上升，緩解K⁺和NO₃⁻含量下降。對于根系來說，MdWRKY71和ALA促進Na⁺和Cl⁻在根系中積累。這種根系截留鹽離子同時減少葉片積累的特性是MdWRKY71和ALA提高植物耐鹽性的重要機制。

Fig. 4 OE-MdWRKY71 and ALA treatment improve salt tolerance in tobaccos

(5) LUC和GUS染色顯示，MdWRKY71可結合（蛋白激酶基因MdSOS2）、離子轉運基因（MdNHX1、MdCLC-g）和抗氧化酶基因（MdSOD1、MdCAT1、MdAPX1）啟動子，并上調基因表達(Fig. 5)。

Fig. 5 MdWRKY71 binds to the promoters of MdSOS2, MdNHX1, MdCLC-g, MdSOD1, MdCAT1, and MdAPX1 to activate gene expressions

EMSA顯示，MdWRKY71可以特異性結合MdSOS2、MdNHX1、MdCLC-g、MdSOD1、MdCAT1，MdAPX1啟動子上的W-box (Fig. 6)。

Fig. 6 EMSA analyses show that MdWRKY71 binds to the W-box of the promoters of MdSOS2, MdNHX1, MdCLC-g, MdSOD1, MdCAT1 and MdAPX1

4. 意義和創新性：

本研究報道，外源ALA可以提高蘋果耐鹽性，MdWRKY71表達可以被鹽脅迫和ALA誘導，并以轉錄因子形式作用于Na⁺和Cl⁻運輸以及抗氧化酶基因啟動子上游，提高基因轉錄活性，促進鹽離子外排出質膜，或區隔化于液泡內。這樣，既避免鹽離子毒害，又作為廉價滲透溶質，提高植株吸水能力；同時，由于上調抗氧化酶基因表達，酶活性提高，可以清除活性氧自由基。因而，本研究成果從離子毒害和氧化脅迫兩個方面解釋了ALA提高蘋果耐鹽性的機理，從而為ALA在蘋果耐鹽實踐中應用提供了理論依據。同時，新挖掘出的MdWRKY71基因可望應用于耐鹽蘋果育種實踐。

作者及其團隊介紹：碩士畢業研究生李亞格和鐘山青年研究員張留孜為該文共同D一作者，汪良駒教授和仲巖副教授為該文通信作者，碩士畢業研究生袁舟宇和科研助理張建婷參與本研究。

汪良駒教授是江蘇省植物生理學會植物生長物質與生長調控委員會主任。他于2000年起開始從事ALA在農林作物抗逆增產提質增效及其生物學基礎研究。其研發的產品“金村秋”、“禾稼春”和“秀果美”等已大面積應用于國內20多個省市區農業生產區。其團隊先后獲得20多項政府專項資金資助，在國內外學術期刊發表與ALA有關研究論文100余篇，授權專利20余項，處于5-A農業領域研究前沿。

基金介紹：該研究獲得自然科學基金(32230097和32172512)、江蘇省碳達峰碳中和前沿基礎專項資金(BK20220005)、江蘇省農業科技自主創新B類項目[CX(20)2023]和江蘇省高校優勢學科等項目的資助。